摘要

　　从土壤中分离得到一株能产高效絮凝剂的菌株，经鉴定为硅酸盐芽孢杆菌，该菌产生的絮凝剂命名为MBFA9，本研究首次发现芽孢杆菌能够产生絮凝剂。该菌产生的絮凝剂MBFA9具有用量少，絮凝效果好等特点。该絮凝剂絮凝5000mg/L的高岭土悬浮液时，不需添加CaCl₂、Al₂(SO₄)₃等助凝剂，絮凝率高达99.6%，絮凝剂（培养液）用量仅为0.1 ml/L，约为一般生物絮凝剂用量的1/10 – 1/200。通过提纯分析得知絮凝剂MBFA9为多糖，由糖醛酸、中性糖和氨基糖组成，其中糖醛酸的含量高达19.1%。粘度法测得絮凝剂MBFA9的平均分子量为2.594×10⁶。动物急毒试验表明该絮凝剂无急毒反应，可以安全使用。絮凝剂MBFA9絮凝河水的用量为0.05ml/L，河水浊度由106.1 mg/L降为0.8 mg/L，而药剂成本仅为0.04元/吨。絮凝剂MBFA9处理淀粉厂的黄浆废水效果良好，SS和COD的去除率分别达到85.5%和68.5%，优于常用的化学絮凝剂。因此，絮凝剂MBFA9在食品废水中回收有价物质和给水中具有很好的应用潜力。

　　微生物絮凝剂因为具有可生物降解、无二次污染等独特性质，近些年来受到人们的广泛关注。目前已发现多种微生物能够产生絮凝剂，如酱油曲霉^[1]、红平红球菌^[2]、拟青霉^[3]产碱菌属^[4]等，但普遍存在絮凝剂用量大、成本高、对实际废水絮凝性差等问题。因此，寻找高效微生物絮凝剂产生菌，提高絮凝活性，降低絮凝剂用量，是微生物絮凝剂能能否在工业上推广的关键所在。本文研究筛选得到的一株高效絮凝剂产生菌，经培养、絮凝实验表明，该菌产生的絮凝剂的絮凝率高、用量低，展示了良好的应用前景。

　　1. 材料和方法

　　1.1 菌种来源

　　 从树丛中的肥沃土壤中分离得到。

　　1.2 菌种鉴定

　　按《一般细菌常用鉴定方法》和《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》 进行鉴定。

　　1.3 培养基(%)及培养条件

　　 可溶淀粉1.5，K₂HPO₄ 0.6，酵母膏0.3 ，MgSO₄·7H₂O 0.02，NaCl 0.01，pH=8.0，在30℃、140 r/min的摇床中培养72h。

　　1.4 絮凝剂的提纯

　　培养液稀释10倍6000r/min离心10min去除菌体，然后浓缩、乙醇沉淀、氯仿正丁醇去除游离蛋白，透析后真空冷冻干燥得到絮凝剂MBFA9精品。

　　1.5 絮凝剂的成分分析

　　通过糖的Molish反应、蒽酮反应以及紫外光谱，定性判断絮凝剂MBFA9样品中是否含有糖类成分^[5]。多糖经水解，可以测出中性糖、酸性糖和氨基糖的含量^[5、6]。中性糖的测定采用酚硫法，己糖醛酸的测定采用咔唑－硫酸法；氨基糖的测定方法见“糖复合物生化技术研究”^[6]。红外光谱测定絮凝剂中所含基团。

　　1.6 絮凝剂分子量测定(粘度法)

　　 试验所用毛细管的直径为0.5 mm，水浴温度为30℃，以1％NaOH 10ml溶解0.01g絮凝剂MBFA9精品，即初始浓度C₀为0.001g/ml，分别测得絮凝剂溶液和纯溶液流出时间，则可求出絮凝剂的分子量^[7] 。

　　1.7 絮凝剂的毒性试验（急性毒性试验测LD₅₀）

　　 试验按“国家食品卫生法则”要求进行急性毒性试验^[8]。取60只小白鼠（由中国医科大学动物部提供），体重为20±2g，雌雄随机分为两组，一组为试验组，另一组为对照组。将絮凝剂MBFA9溶于水中，以1g/kg 的剂量均匀配给各鼠，24小时内喝完，饲养15天，观察小白鼠的体态、饮食、运动有无异常反应。

　　1.8 实际废水的性质

　　废水一：淀粉厂黄浆废水

　　 废水取自沈阳市南塔淀粉厂的沉淀池溢流废水。黄浆水经沉淀池沉淀，大部分黄浆沉淀下来，溢流水排放。废水中仍含有一些细小的悬浮物，主要成分是淀粉和蛋白质。废水指标见表1。

　　Table 1 Index of yellow slurry wastewater

　　废水二：沈阳南湖湖水

　　 浊度为106.1ppm，pH=7.06，COD=79.03mg/L，悬浮物主要为微小的泥土颗粒及少量有机物。

　　2 结果和讨论

　　2.1 菌种鉴定

　　 从土壤中分离筛选得到A-9菌株，该菌株的培养液对高岭土悬浮液的絮凝率高达99.6%。该菌的菌体形状为两端圆形的长杆菌，周生鞭毛，菌体大小为4.16-4.83×0.5-0.83 mm（见图1）；该菌好氧，革兰氏染色为阳性，适宜培养温度为25-30℃，用复红或结晶紫染色时可以见到很大的荚膜，荚膜内含有1-3个菌体。该菌能水解淀粉，不水解酪素，在含淀粉的PDA平板培养基上能形成大量的椭圆形芽孢（见图2）。经鉴定该菌为硅酸盐芽孢杆菌新变种（Bacillus mucilgnons n. var），由该菌产生的絮凝剂命名为MBFA9。

　　 图1 A-9菌株形态的电镜照片(6000倍) 图2 A-9菌株产生的芽孢(1500倍)

　　Fig.1 electron microscope photo of strain A-9’s shape.(6000 times) Fig..2 Gemma produce by strain A-9(1500 times)

　　2.2 絮凝剂MBFA9的絮凝特性

　　絮凝剂MBFA9突出的特点是絮凝效果好、絮凝剂用量少^[9]。当絮凝5000mg/L的高岭土悬浮液时，絮凝剂（培养液）的用量仅为0.05ml/L，为一般微生物絮凝剂用量的1/10 –1/100，而絮凝率高达99.6%，且不需添加Ca²⁺及Al³⁺等助凝剂。

　　 尽管絮凝剂MBFA9絮凝高岭土悬浮液时不需添加CaCl₂，但絮凝其它对象时，CaCl₂的作用非常重要，结果见表2。

　　Table 2 The influence of Ca²⁺ to MBFA9’s flocculating activity dealing with different objects

　　从表2可见，添加CaCl₂对墨汁配水的影响较小，而对印染废水、黄浆废水和泥水的影响较大，絮凝率明显提高。泥水、黄浆废水和印染废水中即有微小的悬浮物又有稳定的胶体，不加CaCl₂时，MBFA9只能絮凝其中的悬浮物，因而絮凝率低；加入CaCl₂后，Ca²⁺能使水中的胶体脱稳，生成小絮团，加入的MBFA9为高分子絮凝剂，能起吸附架桥的作用，使微小颗粒絮凝成大絮团。墨汁配水为典型的胶体溶液，不加CaCl₂时絮凝率为0%，加入CaCl₂絮凝率为31.2%。可见，絮凝剂MBFA9对水中的悬浮物有较好的絮凝效果，对于较稳定的胶体，需要有CaCl₂的协同作用才会有较好的絮凝效果。

　　2.3 絮凝剂MBFA9的分析

　　 为了深入研究絮凝剂MBFA9的絮凝机理，对提纯后得到的絮凝剂精品进行糖、蛋白质的呈色反应。结果表明絮凝剂MBFA9有明显的糖类颜色反应：Molish反应在浓硫酸和样品液分界面上有清晰的紫环生成，蒽酮反应呈现为蓝绿色，而没有蛋白质/氨基酸的特征反应。因而，可以定性地判断出该絮凝剂的有效成分为多糖。

　　多糖是由多种单糖构成的，而单糖又分为中性、酸性和碱性糖。不同多糖组成的絮凝剂分子的结构和性能会有很大差异，测定絮凝剂的多糖组成，可以解释絮凝剂的性能，为研究MBFA9的絮凝机理奠定基础。为此对其进行浓硫酸水解，分别测定絮凝剂中己糖醛酸、氨基糖和中性糖的含量。另外，采用乌氏粘度计对MBFA9的分子量进行测定。结果见表3。用IR-470 红外光谱分析仪，对絮凝剂MBFA9精品进行分析，光谱图见图3 。

　　Table 3 Specialities of flocculant MBFA9

　　Fig.3 IR spectrum of flocculant MBFA9

　　图3 为一个典型的多糖红外光谱图，具有多糖的特征吸收峰3420、2926、1615、1025、810cm^-1，这些特征峰进一步证实絮凝剂MBFA9是多糖。光谱图在1733、1615和1415 cm^-1处有特征吸收峰。1733 cm^-1为—COOH中的C=O伸缩振动所致；而1615 cm^-1处的宽吸收峰为—COO^—中的C=O非对称伸缩振动的结果；1415 cm^-1为—COO^—中的C—O伸缩振动所致。因此可以断定絮凝剂MBFA9中含有羧基，为阴离子絮凝剂。

　　2.4絮凝剂MBFA9的急毒试验 (急毒LD₅₀)

　　微生物絮凝剂是微生物分泌的代谢产物，作为水处理药剂，要求无毒无害。因此，对絮凝剂MBFA9进行急毒试验，结果表明，小白鼠一次性吞食1g/kg的絮凝剂MBFA9后，无一死亡，体态、饮食、运动均无异常反应，LD₅₀>1g/kg，初步证明絮凝剂MBFA9无急毒反应。

　　2.5絮凝剂MBFA9处理实际废水

　　 絮凝剂MBFA9是一种絮凝性能优异的无毒絮凝剂，在对人类或动物直接相关的食品、给水等领域具有广阔的应用前景。本研究以淀粉厂的黄浆废水和河水作为絮凝对象，研究絮凝剂MBFA9的实际应用效果。

　　2.5.1 黄浆废水的处理结果

　　在废水中加入0.5g/L的CaCl₂，再加0.2ml/L MBFA9，后调pH至10.0，絮凝效果最佳，试验结果见表4。试验中发现加入CaCl₂后，生成小絮团，沉降缓慢，加入絮凝剂MBFA9后絮团大且结实，沉降速度快。可见絮凝剂MBFA9絮凝黄浆废水时，CaCl₂有助凝作用。经絮凝处理，SS和COD的去除率分别达到85.5%和68.5%。

　　Table 4 Indexes of yellow slurry wastewater before/after disposal

　　分别用聚合氯化铝、阴离子聚丙烯酰胺（320万）和非离子聚丙烯酰胺（580万）絮凝处理黄浆废水，结果见表5。从表中可以看出聚合氯化铝和非离子聚丙烯酰胺几乎没有絮凝效果；阴离子聚丙烯酰胺效果较明显，悬浮物絮团大，沉降快，最终SS和COD分别为520 mg/L和2330 mg/L，比絮凝剂MBFA9的处理效果略差。可见絮凝剂MBFA9的絮凝效果明显优于常用的化学絮凝剂。处理1吨废水可以回收2 kg沉淀物。沉淀物中含有高蛋白物质，可以作为动物饲料的添加剂加以利用。

　　Table 5 Comparing the disposal effects of yellow slurry wastewater with different flocculants

　　2.5.2絮凝剂MBFA9处理河水

　　 用Al₂(SO₄)₃作凝聚剂，分别以絮凝剂MBFA9、阴离子PAM、海藻酸钠、明胶作絮凝剂，絮凝处理湖水，结果见表6 。从试验结果可以看出，用絮凝剂MBFA9作助凝剂，不仅絮团大，沉降快，上清液清澈，而且处理后COD最小；阴离子PAM、海藻酸钠、明胶处理后的浊度依次增大，COD也随之增加。絮凝剂MBFA9（培养液）的产品价格约为800元/吨，处理湖水的成本约为0.04元/吨。可见，MBFA9完全可以作为高分子絮凝剂应用于给水处理中。

　　Table 6 The disposal results of lake water with MBFA9 and common flocculants

　　3 结论

　　⑴. 筛选得到的高效菌株A-9经鉴定为硅酸盐芽孢杆菌新变种（Bacillus mucilgnons n.var）。A-9是一株性能优异的絮凝剂产生菌，该菌产生的絮凝剂MBFA9絮凝高岭土悬浮液时不需添加CaCl₂作助凝剂，而絮凝其它对象时CaCl₂有较好的促凝作用。毒性试验表明絮凝剂MBFA9无毒无害，可以安全使用。

　　⑵. 对MBFA9的组成、结构及絮凝性进行了系统的分析鉴定，确定絮凝剂MBFA9为酸性多糖，其中糖醛酸、中性糖、氨基糖的含量分别为19.1%、47.4%、2.74%，平均分子量为2.594×10⁶，分子中含有极性较强的—COO^-等亲固基团。

　　⑶. 处理实际废水的试验结果表明，用絮凝剂MBFA9处理黄浆废水和高浊度河水，技术指标优于聚铝、PAM等常规化学絮凝剂。絮凝剂MBFA9处理黄浆废水，SS和COD的去除率分别可达85.5%和68.5%；处理河水浊度降至0.8ppm。

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